生物化学实验报告
姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别：
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
肝糖原的提取、鉴定与定量
实验日期
实验地点
合作者
指导老师
评分
XX 教师签名 李某某 批改日期 2013-06-03
格式要求： 正文请统一用： 小四号，宋体， 1.5倍行距；数字、英文用 Times New Roman； 标题用： 四号，黑体，加粗 。需强调的地方请用 蓝颜色标出。
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一、实验目的
1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。
2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项， 掌握其操作方法。
3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。
4、熟练运用溶液混匀的各种方法。
5、正确掌握溶液转移的操作。
6、正确操作使用分光光度计。
二、实验原理
1、肝糖原的提取与鉴定
糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋 白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使 用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。
糖原不溶于乙醇而溶于热水， 故先用 95％乙醇将 滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。
糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中， 依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应 和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。
CuSO4十 2NaOH = Na2SO4+Cu（OH）2↓
2Cu（OH）2十C6H12O6 = 2CuOH十氧化型葡萄糖 +H2O
2CuOH = Cu2O↓（红色 ）+H2O
Cu（OH）2= CuO↓（黑色）+H 2O
2、肝糖原定量测定
糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖， 浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物— —5- 羟甲基呋喃甲醛， 此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。
该物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在 （10~100）g 范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色， 通过标准对照法（直接比较法） 即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先 臵于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。
三、材料与方法： 以流程图示意
1、材料：
（1）样品：鸡肝
（2）试剂： 95%乙醇、 5%（ W/V ）三氯乙酸、浓盐酸、 12.5mol/L（50%）NaOH溶液、 碘试剂、班氏试剂、 5.35mol/L（ 30%）KOH 溶液、标准葡萄糖液（ 50mg/L）、蒽酮显 色剂
（ 3）仪器和器材：普通离心机、室温 -100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天 平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm 试管、刻度吸量管 （2ml、 5ml）、 1000μl 微量可调取液器、 100ml 容量瓶、白瓷反应板
2、方法：
1）肝糖原的提取与鉴定
鸡肝约 1g，剪碎
+5%CCl 3COOH 1ml
研磨至乳状
+5%CCl3COOH 3ml
研磨成肝匀浆
全部转入离心管中， 离心 3min（ 4000r/min ）
沉淀（弃去）上清液（取
沉淀（弃去）
上清液（取 2ml）
+2ml 95%
+2ml 95% 乙醇，混匀，静置 10min
离心 5min( 4000r/min )
上清液（弃去）沉淀
上清液（弃去）
沉淀
沸水浴 2min ，溶解沉淀
沸水浴 2min ，溶解沉淀
白瓷板孔穴中
糖原溶液 1ml
加碘试剂 2 滴 糖原溶液 2
加碘试剂 2 滴 糖原溶液 2 滴
加碘试剂 2 滴
+ 浓 HCL5 滴
沸水浴 15min ，冷却
呈色对比+50%NaOH 5
呈色对比
+50%NaOH 5 滴
糖原水解液 2
糖原水解液 2 滴
糖原水解液
+班氏试剂 4 滴
混匀
沸水浴 2min ，观察变化
2）肝糖原定量测定
四、结果与讨论： ①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑 推论，并得出结论。
1、结果：
（1）实验现象：
1）肝糖原的提取与鉴定
第一次离心后，肝匀浆分为 2 层，上层为上清液，不完全澄清，下层为淡褐色沉淀
图1
图1 肝匀浆 图2 肝匀浆第一次离心后
加入乙醇混匀并静置后，溶液分层，上层为上清液，下层有白色絮状沉淀。
第二次离心后，溶液分为 2 层，上层为上清液，试管底部有少量白色沉淀
加入蒸馏水并沸水浴后，白色沉淀溶解
白瓷板上，糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，与碘自身的黄色有明显区别
碘试剂 2 滴
图4 呈色对比结果（左为糖原溶液加碘试剂，右为碘试剂）
往糖原水解液中加入班氏试剂后，溶液呈蓝色（班氏试剂本身为蓝色）。沸水浴后，
溶液变为砖红色（生成砖红色沉淀）。
图5 糖原水解液图 6 沸水浴前砖红色沉淀
图5 糖原水解液
图 6 沸水浴前
砖红色沉淀
图 7 沸水浴后
2）肝糖原定量测定
往鸡肝中加入 KOH 并沸水浴后，溶液变为红棕色。
图
图
水浴前，空白管呈黄色，标准管呈绿色，样品管呈黄色（颜色比空白管浅）。水浴后，
空白管无明显变化， 标准管颜色略变深， 样品管由黄色变为深绿色 （颜色比标准管深）
图 9 水浴前 图 10 水浴后
2）实验数据：
测定次数 标准管 样品管
TOC \o "1-5" \h \z 0.593 0.401
0.593 0.397
0.594 0.396
平均值 0.593 0.398
表1 标准管和样品管测得的吸光度（ A620）及平均值 按下式计算样品中肝糖原的含量：
A 样品 100 100 肝糖原（ g/100g肝组织） = * 0.05 * * * 1.11
A 标准 肝组织重（ g） 1000
由于样品稀释了一倍，因此计算结果需乘二。
结果：肝糖原的含量为 4.966g/100g 肝组织。
故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝组织，且肝糖原含量为 4.966g/100g 肝组织。
2、讨论：
（ 1）实验数据分析：本次实验测得肝糖原含量为 4.966g/100g肝组织。查书得饱食鸡肝 肝糖原含量为 2~3g/100g 肝组织。本次实验结果偏大，说明肝组织中含有过多肝糖原， 试验所用鸡肝为脂肪肝。
2）呈色对比结果分析：糖原溶液与碘试剂反应呈红棕色，与碘试剂本身的黄色区别
明显，说明糖原含量较大。
（3）糖原水解液与班氏试剂反应结果分析：该反应主要是通过检测葡萄糖与班氏试剂 的还原性糖反应间接鉴定溶液中糖原的存在。糖原溶液被浓盐酸水解为葡萄糖，葡萄糖 中的醛基可被 Cu（OH）2 氧化为羧基，即把葡萄糖氧化为葡萄糖酸， Cu2+则被还原生成 Cu2O 砖红色沉淀。因此水浴后，溶液由蓝色变为砖红色，实验现象明显。
（4）注意事项： 1）蒽酮试剂为浓硫酸所配制，使用时应小心谨慎。若不慎沾到皮肤上，应立即用大量 清水冲洗。
2）离心后，用移液枪吸取上清液时应避免枪头触及沉淀，否则会使沉淀物上浮，导致 上清液浑浊。避免将枪头伸到液面下再按按钮，否则枪头喷出的气泡也会激起沉淀物。
3）打开室温 -100℃恒温水浴箱盖子时要小心水蒸气，以免烫伤。
4）使用离心机时要注意配平，否则会损坏离心机。
5）使用分光光度计时不得在仪器界面上转移试剂，以免腐蚀分光光度计。
6）肝糖原提取中，往上清液加入 95%乙醇时要充分混匀。溶液总量较大，混匀操作不 易，可用倾倒混匀或用玻璃棒搅拌混匀。
7）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。
8）蒽酮试剂必须 2 倍于被测液