生物化学实验报告
姓 名:
学 号:
专业年级:
组 别:
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量
实验日期
实验地点
合作者
指导老师
评分
教师签名
批改日期
实验目得
１、1。学习醋酸纤维薄膜电泳得基本原理与操作方法;
1.2、了解电泳技术得一般原理;
１.3、掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量得方法、
二、实验原理
2、1、血清中各种蛋白质得等电点不同,一般都低于pH７。4。它们在pH8、６得缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带得电荷量不同,在醋酸纤维素薄膜上电泳得速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(Alｂumｉn)、α1－球蛋白、α２-球蛋白、β—球蛋白、γ－球蛋白5条区带。
2、２。血清中不同蛋白质得等电点、分子量及含量
血清蛋白质 等电点 分子量 占总蛋白得％
清蛋白 4、6４ 69,000 ５７～７2
α1－球蛋白 5、06 ２０0,000 ２～5
α2-球蛋白 5。0６ 300,０00 ４～9
β－球蛋白 ５.１2 90,０00~150,0０0 6、5~12
γ－球蛋白 6。85～7、3 1５６,０00～９５0,０００ 12~2０
缓冲液pＨ=８.6,pI〈pH。
血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。
预测血清蛋白电泳区带图
血清蛋白依次分为清蛋白,球蛋白得α1、α２、β、γ五个区带
2、3。①膜条经过氨基黑1０B染色后显出清晰色带;②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比;③可将各色带剪开,分别溶于碱性溶液中;④用分光光度法计算各种蛋白质得百分数。
三、材料与方法:
3.1.实验材料:
3、1。１.实验试剂:①样品:健康人血清(新鲜、无溶血);②巴比妥－巴比妥钠缓冲液(ｐH8。６,离子强度0.06mｏl/L);③氨基黑1０B染色液;④漂洗液;⑤洗脱液:0、4moｌ/ＮａOＨ溶液。
３。1、2。实验器材:①Ｖ-1100分光光度计(×1);②恒温水浴箱(×１);③试管(×6)、试管架(×1);④1000μL加样枪(×1)、加样枪架(×1);⑤醋酸纤维薄膜(2cm*８ｃm,厚度１20μm);⑥培养皿(×5);⑦点样器或载玻片(×1);⑧平头镊子(×2);⑨剪刀(×１);⑩电泳槽(×１);?直流稳压电泳仪(×１)
3。２。实验步骤
准备与点样:①取2×8cm得膜条;②亚光面距一端1、5cm处取一点样线;③充分浸透在巴比妥缓冲液中;④取出膜条,用滤纸吸去多余得缓冲液;⑤点样器下端粘上薄层血清;⑥垂直点样。
点样示意图:
注意:点样线尽量点得细窄而均匀。
+——8cm
+
——
8cmm
2cm
点样线
点样区
1、5cm
(粗面)
小组标记
小组标记
样品标记
样品标记
电泳:①放置膜条(点样面向下,点样端置于阴极);②膜条贴紧滤纸,拉直膜条;③平衡五分钟;④通电(调节电压1２0v/电流,时间:4５～６0 ｍin);③关闭电源。
电泳槽解剖图:
３.染色、漂洗:①通电完毕;②取出膜条;③浸于染色液(氨基黑10Ｂ)中,５miｎ;④取出膜条,浸于漂洗液;⑤反复漂洗2次,直至漂净;⑥滤纸吸干薄膜。
4.定量(洗脱比色法)(因实验室等原因,未做)
四、结果与讨论:
图一 染色后得膜条
4.１、结果分析
本次实验得到得图谱只能够清晰得瞧出清蛋白与γ－球蛋白得区带,其余无法区别、原因可能如下:
①醋酸纤维薄膜质量不足
②薄膜过湿,样品扩散迅速,导致样品分离不成区带、
③点样太少,区带显色不明显、
④电泳时间不足。
⑤薄膜在缓冲液中浸泡得时间不足。
⑤取出电泳后得薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上、
⑥染色时,因为现场混乱,可能导致醋酸纤维薄膜不就是一张一张放入染色液得,在染色固定前,薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定得血清蛋白彼此粘连、
４、2.课后思考题
电泳时,点样端置于电场得正极还就是负极？为什么？
答:点样端置于电场得负极。因为人体血清得蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电,要成功分离出各类各类蛋白质,理应将点样端置于电场得负极、
电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在得原因。
答:①醋酸纤维薄膜质量不足;②薄膜过湿,样品扩散迅速,导致样品分离不成区带;③点样太少,区带显色不明显;④染色时,醋酸纤维薄膜不就是一张一张放入染色液得,在染色固定前,薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定得血清蛋白彼此粘连。⑤电泳时电压,电流或电泳过小或时间不够,造成区带未分离。